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食品安全現(xiàn)代生物檢測技術(shù)

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第六章  食品安全現(xiàn)代生物檢測技術(shù)

第一節(jié) 免疫學(xué)檢測技術(shù)
第二節(jié) PCR檢測技術(shù)
第三節(jié) 轉(zhuǎn)基因食品的檢測技術(shù)
第一節(jié) 免疫學(xué)檢測技術(shù)
一、概述
        抗原與抗體的結(jié)合反應(yīng)是一切免疫測定技術(shù)的最基本原理。在此基礎(chǔ)上結(jié)合一些生化或理化方法作為信號顯示或放大系統(tǒng)即可建立免疫測定法，如放射免疫測定法、酶免疫測定法、熒光免疫測定法等。一個(gè)成功的免疫測定法必須具備3個(gè)要素：性能優(yōu)良的抗體、靈敏和專一性的標(biāo)記物和高效的分離手段。按照是否使用標(biāo)記物分為標(biāo)記免疫測定法和非標(biāo)記免疫測定法，后者又稱為經(jīng)典免疫測定法；按反應(yīng)介質(zhì)分為均相或非均相(免疫復(fù)合物需分離后檢測)免疫測定法；按反應(yīng)狀態(tài)分為平衡態(tài)或非平衡態(tài)免疫測定法。按照標(biāo)記物種類，標(biāo)記免疫測定法又分為放射性標(biāo)記測定法和非放射性標(biāo)記測定法。
目前最常用的免疫學(xué)檢測技術(shù)如下：
（1）放射免疫測定技術(shù)  
（2）酶免疫測定技術(shù)
（3）熒光免疫測定技術(shù)
（4）發(fā)光免疫測定技術(shù)
（5）膠體金免疫測定技術(shù)
二、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)
（一）ELISA的基本原理
        ELISA(Enzyme-Linked immunosorbent assay)的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。這一方法的基本原理如下。
       （1）使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，井保持其免疫活性；
       （2）使抗原或抗體與某種酶連接成酶標(biāo)抗原或抗體，這種酶標(biāo)抗原或抗體既保留其免疫活性．又保留酶的活性。
（二）ELISA的類型
        ELISA可用于測定抗原，也可用于測定抗體。用于臨床檢驗(yàn)的ELISA主要有以下幾種類型。
1 雙抗體夾心法測抗原
2 雙抗原夾心法測抗體
3 間接法測抗體
4 競爭法測抗體
5 競爭法測抗原
（三）ELISA的材料與試劑
        完整的ELISA試劑盒包含以下各組分：已包被抗原或抗體的固相載體（免疫吸附劑）；酶標(biāo)記的抗原或抗體（結(jié)合物）；酶的底物；陰性對照品和陽性對照品（定性測定中），參考標(biāo)準(zhǔn)品和控制血清（定量測定中）；結(jié)合物及標(biāo)本的稀釋液；洗滌液；酶反應(yīng)終止液。
1 免疫吸附劑 
2 結(jié)合物 
3 酶的底物
4 洗滌液
5 酶反應(yīng)終止液
6 陽性對照品和陰性對照品
7 參考標(biāo)準(zhǔn)品
三、磺胺二甲嘧啶的間接競爭ELISA檢測
（一）人工完全抗原的合成
（二）合成抗原的鑒定
（三）抗體的制備與純化
（四）標(biāo)準(zhǔn)競爭抑制曲線的制作
（五）畜產(chǎn)品中SM2殘留的ELISA檢測
（六）方法評價(jià)
1  特異性
2  靈敏度
3  準(zhǔn)確度
4  精確度
第二節(jié)PCR檢測技術(shù)
一、概述
        PCR又稱聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase chain reaction)，是1985年由美國的Kary Mullis首創(chuàng)并由美國Cetus公司開發(fā)的一項(xiàng)體外擴(kuò)增DNA的方法。應(yīng)用該方法可使極微量的特定DNA片段在幾小時(shí)內(nèi)迅速擴(kuò)增至百萬倍，因而一經(jīng)問世便在短短的數(shù)年內(nèi)就得到了迅速發(fā)晨和實(shí)際應(yīng)用，并在原有基礎(chǔ)上結(jié)合各種生化分子生物學(xué)技術(shù)衍生出了許多改良技術(shù)。這些技術(shù)顯示出了巨大的潛力，發(fā)揮著越來越大的作用，也正因?yàn)槿绱怂鼈儽蛔u(yù)為20世紀(jì)80年代分子生物學(xué)革命和生物技術(shù)的飛躍。
（一）PCR原理
        PCR是依據(jù)DNA模板的特性，模仿體內(nèi)的復(fù)制過程，在體外合適的條件下以單鏈DNA為模板，以人工設(shè)計(jì)和合成的寡核苷酸為引物，利用熱穩(wěn)定的DNA聚合酶延5’-3’方向摻人單核苷酸來特異性的擴(kuò)增DNA片段的技術(shù)。
（二）PCR反應(yīng)體系
        PCR反應(yīng)體系主要由引物、dNTP、DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶)、緩沖液、Mg2+和核酸模板組成。
（三）PCR反應(yīng)參數(shù)
        在PCR反應(yīng)中每輪循環(huán)的各步反應(yīng)時(shí)間不應(yīng)過長，以免降低TaqDNA聚合酶的活性。下面介紹PCR反應(yīng)中的一些具體參數(shù)。
1.變性    
2.退火  
3.延伸  
4.循環(huán)次數(shù)
 （四）常見的PCR種類
1.熱啟動(dòng)PCR    
2.一步單管PCR    
3.多重PCR
4.依賴PCR的DNA指紋圖譜技術(shù)  
5.PCR-單鏈構(gòu)想多態(tài)性分析
6.mRNA差異顯示技術(shù)  
7.隨機(jī)引物擴(kuò)增DNA多態(tài)性（RAPD）
8.以微衛(wèi)星DNA介導(dǎo)的PCR技術(shù)
9.基因間重復(fù)性回文片段（REP）和基因內(nèi)重復(fù)性一致序列（ERIC）的擴(kuò)增
10.擴(kuò)增片段長度多態(tài)性分析（AFLP）
11.限制性長度多態(tài)性分析（RFLP）
12.用于RNA病毒檢測的核酸擴(kuò)增技術(shù)
（五）PCR技術(shù)用于檢測的主要步驟
（1）運(yùn)用化學(xué)手段對目標(biāo)DNA進(jìn)行提取。
（2）設(shè)計(jì)并合成引物，引物設(shè)計(jì)或合成的好壞直接決定PCR擴(kuò)增的成效。
（3）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
（4）克隆并篩選鑒定PCR產(chǎn)物，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳、染色，在紫外光照射下可見擴(kuò)增特異區(qū)段的DNA帶．根據(jù)該帶的不同即可鑒定不同的DNA。
（5）DNA序列分析
第三節(jié)  轉(zhuǎn)基因食品的檢測技術(shù)
一、概述
        轉(zhuǎn)基因食品又稱遺傳修飾食品（genetically modified food），簡稱GMF或GM食品。轉(zhuǎn)基因食品大體上分為如下三類。
（1）轉(zhuǎn)基因植物食品  由轉(zhuǎn)基因植物如轉(zhuǎn)基因的玉米、大豆、水稻、馬鈴薯、番茄、香蕉、蘋果、菠菜等生產(chǎn)加工而成。
（2）轉(zhuǎn)基因動(dòng)物食品  如轉(zhuǎn)基因的魚、雞、牛、羊等。目的主要通過導(dǎo)入外源基因或?qū)ψ陨砘蚣右孕揎梺硎故荏w動(dòng)物降低結(jié)締組織交聯(lián)度、改善肉質(zhì)．或使受體生物個(gè)體肥大，或生產(chǎn)營養(yǎng)價(jià)值高的蛋、肉、乳等。
（3）轉(zhuǎn)基因微生物食品  如轉(zhuǎn)基因微生物發(fā)酵而制得的葡萄酒、啤酒、醬油等，此類食品是利用轉(zhuǎn)基因微生物（如轉(zhuǎn)基因酵母和酶）的作用而生產(chǎn)出來的食品。后兩類轉(zhuǎn)基因食品目前在市場上還很少。
（一）ELISA技術(shù)與轉(zhuǎn)基因食品檢測
 l.ELISA基本原理
        建立在抗體抗原免疫學(xué)反應(yīng)的基礎(chǔ)上。 
        ELISA分析法必須具備待檢測的固定相抗原或抗體、酶標(biāo)記的抗原或抗體、酶作用的底物三種試劑，且滿足兩個(gè)前提條件：
        待檢測的抗原或抗體能夠結(jié)合到不溶性載體表面并保持活性；
        標(biāo)記酶能與抗原或抗體結(jié)合并同樣 保持各自生物活性。
        ELISA分析基本步驟如下：①將抗原（Ag）或抗體Ab結(jié)合到固相載體平板的孔里；②待測溶液的特殊抗原或抗體結(jié)合到敏化載體表面；③加入酶標(biāo)抗體使之與抗原或抗體化合物相結(jié)合；④結(jié)合物通過標(biāo)記酶催化底物的顏色改變而被檢測；⑤通過最后溶液的顏色深淺對待側(cè)抗原或抗體進(jìn)行定量分析。
2.ELISA分析法的靈敏度
3.ELISA分析法的要點(diǎn)
        特異性高，獲得結(jié)果快，儀器簡單，易于操作，對人員要求不高。免卻了對樣品進(jìn)行核酸提取的麻煩，同時(shí)可降低檢測的成本，由于酶既有很高的催化效率，可極大的放大反應(yīng)效果，從而使測定達(dá)到很高的靈敏度和穩(wěn)定性。

(二）PCR技術(shù)與轉(zhuǎn)基因食品的檢測
 1.PCR技術(shù)對轉(zhuǎn)基因食品的定性檢測
（1）PCR基本原理  PCR技術(shù)由美國Centus公司Kary Mullis發(fā)明，20世紀(jì)90年代逐漸成熟應(yīng)用。簡單地說PcR就是利用核酸DNA聚合酶、引物和4種脫氧單核苷酸在試管內(nèi)完成模板DNA的快速復(fù)制． 
（2）PCR技術(shù)檢測轉(zhuǎn)基因食品的技術(shù)關(guān)鍵和理論依據(jù)

（3）PCR檢測轉(zhuǎn)基因食品的基本步驟  
        ①待檢材料DNA提取：通常利用CTAB法從食品材料中提取核酸；
        ②PCR反應(yīng)：設(shè)計(jì)合適引物。PCR擴(kuò)增待檢樣品中的靶標(biāo)DNA；
        ③觀測PCR產(chǎn)物：通過凝膠電泳分析將PCR產(chǎn)物展現(xiàn)；
        ④確定結(jié)果：有時(shí)為了避免假阻性，還需要對PCR產(chǎn)物進(jìn)行限制性酶切分析進(jìn)行質(zhì)量控制。
2.PCR技術(shù)對轉(zhuǎn)基因食品的定量檢測
        目前基于GMO特異DNA片段的定性PCR篩選方法已廣泛應(yīng)用于GMO食品檢測．但是隨著各國有關(guān)GMO標(biāo)簽法的建立和不斷完善，對食品中的GMO含量的下限已有所規(guī)定。為此，研究者在定性篩選PCR方法的基礎(chǔ)上發(fā)展了不同的定量GMO的PCR檢測方法。目前，國外較為成熟的方法主要有半定量PCR法、定量競爭PCR(Quantitative competitive PCR)和Real—time PCR(實(shí)時(shí)定量PCR)法等三種。
（1）半定量PCR法 
①樣品DNA的提取和定量。
        按常規(guī)方法提取DNA后，取部分樣品DNA在0.8％瓊脂糖凝膠中電泳，與已知古量的Marker比較，用計(jì)算機(jī)凝腔成像分析系統(tǒng)處理結(jié)果，以確定所提取的DNA量。例如，一般700mg的玉米粉可提取lμg DNA。
②PCR反應(yīng)。
       a.樣品DNA的質(zhì)量分析
       b.建立內(nèi)部參照反應(yīng)體系
       c.測定CaMV35S啟動(dòng)子的定量PCR反應(yīng)
（2）定量競爭PCR法   PCR反應(yīng)實(shí)質(zhì)是對特定模板DNA的指數(shù)擴(kuò)增放大，而在相同的條件下，獲得DNA的量與最初模板DNA的濃度成正相關(guān)，競爭定量PCR就是依據(jù)這種擴(kuò)增DNA與模板DNA之間的濃度相關(guān)性設(shè)計(jì)的?；驹硎窍葮?gòu)建含有修飾過的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)DNA片段(競爭DNA)，競爭DNA由質(zhì)粒組成，帶有一個(gè)改造PCR擴(kuò)增子，改造部分可以是DNA插人序列、缺失序列或者點(diǎn)突變，競爭DNA與待測目標(biāo)DNA在同一反應(yīng)管中進(jìn)行PCR共擴(kuò)增，因競爭DNA片段和待測DNA的大小不同，經(jīng)瓊脂糖凝膠可將兩者分開，通過比較兩種條帶的量可進(jìn)行定量分析。
（三）生物芯片與轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測
        就目前轉(zhuǎn)基因食品檢測中常用的ELISA和PCR技術(shù)而言，最大的缺點(diǎn)是檢測范圍窄，效率低，無法高通量大規(guī)模地同時(shí)檢測多種樣品，尤其是對轉(zhuǎn)基因背景一無所知的情況下。對各種候選待檢基因序列或蛋白的逐一篩查幾乎是不可能的。而目前正在研究的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品所涉及的基因數(shù)量有上萬種，今后都有可能進(jìn)入商品化生產(chǎn)，顯而易見對進(jìn)出口產(chǎn)品的檢測，需要有更有效的、快速、特別是高通量的檢測方法，最近幾年出現(xiàn)的生物芯片技術(shù)能較好地解決這一問題。生物芯片根據(jù)所載探針種類分為基因芯片和蛋白質(zhì)芯片兩大類：基因芯片以DNA為探針。依據(jù)核酸雜交的原理檢測樣品中的特定基因序列；蛋白質(zhì)芯片以蛋白質(zhì)為探針，依據(jù)抗原抗體反應(yīng)的免疫學(xué)原理檢測樣品中的特定蛋白質(zhì)。

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