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實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在食用油脂檢測(cè)中的應(yīng)用

文檔作者：劉鵬飛1 馬靜1 江曉穎2 劉靜雯1 3 蘇國(guó)成1 4 李健1 3, 4* ( , 廈文檔來(lái)源： 1. 集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院 2. 廈門中集信檢測(cè)技術(shù)有限公司 3. 廈門市海洋功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 4. 廈門市食品科技研發(fā)檢測(cè)中心		點(diǎn) 擊數(shù)：	更新時(shí)間： 2025年07月02日
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第8 卷 第2 期 食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào) Vol. 8 No. 2
2017 年2 月 Journal of Food Safety and Quality Feb. , 2017
基金項(xiàng)目: 教育部留學(xué)回國(guó)人員科研啟動(dòng)基金、福建省教育廳科研項(xiàng)目 (JA15276)、廈門南方海洋研究中心項(xiàng)目 (13PZP002SF24、
14CZP047HJ21)、集美大學(xué)科研基金資助
Fund: Supported by the Scientific Research Foundation for the Returned Overseas Chinese Scholars, State Education Ministry, Foundation of
Education Department of Fujian Province (JA15276), Xiamen Southern Oceanographic Center (13PZP002SF24, 14CZP047HJ21) and the
Scientific Research Foundation of Jimei University
*通訊作者: 李健, 副教授, 主要研究方向?yàn)槭称钒踩?、食品生物技術(shù)、天然化合物, E-mail: lijian2013@jmu.edu.cn
*Corresponding author: LI Jian, College of Food and Bioengineering, Jimei University, Xiamen Key Laboratory of Marine Functional Food,
Xiamen Food Research and Inspection Center, Xiamen 361021, China. E-mail: lijian2013@jmu.edu.cn
實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技術(shù)在食用油脂檢測(cè)中的應(yīng)用
劉鵬飛1, 馬 靜1, 江曉穎2, 劉靜雯1, 3, 蘇國(guó)成1, 4, 李 健1, 3, 4*
(1. 集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院, 廈門 361021; 2. 廈門中集信檢測(cè)技術(shù)有限公司, 廈門 361021;
3. 廈門市海洋功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廈門 361021; 4. 廈門市食品科技研發(fā)檢測(cè)中心, 廈門 361021)
摘要: 熒光定量PCR 檢測(cè)技術(shù)具有快速、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn), 在轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。采用
熒光定量PCR 技術(shù)進(jìn)行油脂轉(zhuǎn)基因、摻假檢測(cè)也成為研究熱點(diǎn)。利用不同油料作物所含有的獨(dú)特核酸序列, 采
用熒光定量PCR 技術(shù)可簡(jiǎn)單、高效、快速地檢測(cè)出油脂中所含的特定核酸成分, 從而判定油脂原料的構(gòu)成, 為
打擊食用油脂摻假造假提供判定依據(jù)。植物油的加工過(guò)程中都經(jīng)過(guò)多個(gè)步驟的處理, 其中的核酸降解嚴(yán)重, 含
量極低, 所以從植物油中提取出較高質(zhì)量的DNA 是對(duì)油脂進(jìn)行熒光定量PCR 檢測(cè)鑒定的關(guān)鍵。本文主要對(duì)
油脂DNA 提取方法及存在的難點(diǎn)、引物設(shè)計(jì)特點(diǎn)和結(jié)果分析進(jìn)行了論述, 以期為今后熒光定量PCR 檢測(cè)技
術(shù)進(jìn)一步推廣與應(yīng)用提供思路。
關(guān)鍵詞: 實(shí)時(shí)熒光定量PCR; 食用油脂; DNA 提取
Application of real-time fluorescent quantitative PCR technology in the
detection of edible oils
LIU Peng-Fei1, MA Jing1, JIANG Xiao-Ying2, LIU Jing-Wen1,3, SU Guo-Cheng1,4, LI Jian1, 3,4*
(1. College of Food and Bioengineering, Jimei University, Xiamen 361021, China; 2. Xiamen Zhongjixin Testing Co.,
Ltd., Xiamen 361021, China; 3. Xiamen Key Laboratory of Marine Functional Food, Xiamen 361021, China;
4. Xiamen Food Research and Inspection Center, Xiamen 361021, China)
ABSTRACT: Fluorescence quantitative PCR technology has been widely used in the detection of genetically
modified food and other fields for its quickness and accuracy, and it also becomes popular in transgenic detection and
adulteration detection of edible oil. By taking advantage of the unique nucleic acid sequence of different species, the
specific nucleic acid composition contained in different oil crops can be detected, and the raw material constituent of
edible oil can be predicated, so as to provide the evidence for administrative organization to punish the adulterations
of edible oil. The quantity and integrity of DNA of edible oil is very low due to the multiple refined processes. It is
critical to get high quality DNA from edible oils for real-time fluorescent quantitative PCR analysis. This article
mainly reviewed methods and existing problems of DNA extraction, primer design characteristics and result analysis,
so as to provide perspectives for further application of real-time fluorescent quantitative PCR in future.
KEY WORDS: real-time fluorescent quantitative PCR; edible oils; DNA extraction
萬(wàn)方數(shù)據(jù)
526 食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào) 第8 卷
1 引 言
食用油是居民飲食中不可缺少的一部分, 為有效監(jiān)
控食用油脂安全, 監(jiān)管部門和研究者提出了多種檢測(cè)方法
[1,2]。通常主要的油脂檢測(cè)指標(biāo)有酸價(jià)[3]、膽固醇[4]、過(guò)氧
化值[5]、揮發(fā)性成分[6]等, 主要檢測(cè)技術(shù)有近紅外光譜[7]、
電導(dǎo)率與極性物質(zhì)測(cè)定[8]、氣相色譜[9]和質(zhì)譜法[10]等。隨
著各種檢測(cè)方法的優(yōu)化, 一些新型的檢測(cè)技術(shù)也逐漸出現(xiàn),
諸如電子鼻[11]、快速檢測(cè)試紙[12]、核磁共振[13]等。具體的
方法應(yīng)用有: 利用分光光度法特征波長(zhǎng)檢測(cè)花生油中的棉
籽油[14], 紅外光譜法鑒定橄欖油[6], 氣相色譜法構(gòu)建特征
模型檢測(cè)大豆油中的棕櫚成分[15]等。上述方法有其使用的
優(yōu)點(diǎn), 但也有其局限性, 如無(wú)法檢測(cè)油脂的轉(zhuǎn)基因成分,
無(wú)法鑒別使用油脂的摻假使假, 不能分辨出地溝油中的微
生物污染, 電子設(shè)備檢測(cè)所需的成本較高在實(shí)際應(yīng)用時(shí)不
具普遍性等。
核酸作為每個(gè)物種的～身份證～, 具有性質(zhì)穩(wěn)定、特異
性好、PCR 擴(kuò)增后產(chǎn)生特征片段明顯等特點(diǎn), 尤其在臨床
檢測(cè)方面的應(yīng)用廣泛。在轉(zhuǎn)基因食品成為熱門話題的今天,
轉(zhuǎn)基因成分的潛在危險(xiǎn)性不明, 有些產(chǎn)品沒有明確標(biāo)識(shí)轉(zhuǎn)
基因成分而對(duì)消費(fèi)者產(chǎn)生誤導(dǎo)等負(fù)面影響。由于食用油脂
生產(chǎn)原料包括轉(zhuǎn)基因大豆、油菜籽等, 使得熒光定量PCR
技術(shù)成為食用油脂的轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)首選技術(shù), 實(shí)現(xiàn)油脂
分子水平檢測(cè)成為發(fā)展趨勢(shì)[16]。該技術(shù)操作簡(jiǎn)便, 通過(guò)設(shè)
備的自動(dòng)分析可同時(shí)檢測(cè)幾十個(gè)樣品, 整個(gè)檢測(cè)過(guò)程耗時(shí)
短。本文主要從食用油脂中DNA 的提取、引物設(shè)計(jì)、熒
光定量PCR 在油脂檢測(cè)中的具體應(yīng)用和結(jié)果分析等方面
介紹實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)及其在食用油脂安全檢測(cè)中
的應(yīng)用。
2 食用油脂中DNA 的提取
食用油脂包括可食用動(dòng)物油脂和植物油脂, 植物油
脂根據(jù)提取工藝不同又分為壓榨型和浸提型, 制取時(shí)精煉
程度的不同使得壓榨型較浸提型油脂中核酸含量高。但無(wú)
論是動(dòng)物油還是植物油在生產(chǎn)過(guò)程中均要經(jīng)歷高溫、脫色
和脫臭等處理, 核酸片段在各個(gè)階段發(fā)生不同程度的降解,
破碎后的DNA 片段小于200 bp, 因此實(shí)現(xiàn)DNA 分子的富
集是實(shí)現(xiàn)熒光定量PCR 技術(shù)在油脂檢測(cè)中應(yīng)用的前提。
在提取過(guò)程中如何富集和脫脂是能否成功提取到核
酸的關(guān)鍵。核酸易溶于水或緩沖液, 油樣中核酸提取液多
采用無(wú)菌水、十六烷基三甲基溴化銨(cetyltrimethyl
ammonium bromide, CTAB)緩沖液和三羥甲基氨基甲烷-乙
二胺四乙酸(Tris-EDTA, TE)緩沖液。振蕩提取時(shí), 由于振
速過(guò)高易產(chǎn)生乳化層, 因此需要利用有機(jī)溶劑消除乳化,
有機(jī)試劑可選用正己烷、乙醚和丙酮等; 而對(duì)于蛋白含量
較高的原料, 為了減少蛋白質(zhì)對(duì)核酸測(cè)定及PCR 過(guò)程的干
擾, 將會(huì)進(jìn)一步用氯仿-酚純化DNA。一般要求用于PCR
擴(kuò)增的模板DNA 純度OD260/OD280 值在1.8～2.0, 若低于
1.8 說(shuō)明存在蛋白或苯酚的殘留, 模板純度不高。對(duì)油脂
DNA 提取而言, 徹底除去苯酚是純化DNA 的關(guān)鍵步驟。
在DNA 粗提階段, 通常采用提取液體積與油樣體積
比例為1:10。食用原油中DNA 殘留量較為理想, 而對(duì)于精
煉程度很高的商品油可能需要增加油樣比例富集DNA。水
油混合振蕩利于DNA 分子萃取, 而此過(guò)程易形成乳化層,
造成水油分相困難, 在后續(xù)的研究中還應(yīng)確定合適的振搖
條件, 某些顏色較深的原油還會(huì)有色素沉淀, 需要根據(jù)不
同油樣種類作相應(yīng)調(diào)整, 同時(shí)配合有機(jī)試劑處理。
一般油樣提取步驟如下: ①1 mL 提取液加入1 g 豬油
溶化豬油, 室溫振蕩10 min; ②12000 r/min 離心10 min, 棄
去上層油脂, 再加入溶化豬油, 重復(fù)10 次左右, 提取液與
豬油比例約1:10; ③利用CATB 法[17]進(jìn)行后續(xù)處理, 氯仿-
異戊醇-酚除去有機(jī)溶劑, 異丙醇或乙醇沉淀DNA; ④復(fù)溶
DNA。同時(shí)可以配合離心柱, 使獲得的DNA 純度更高。
3 引物設(shè)計(jì)[18,19]
設(shè)計(jì)引物是實(shí)現(xiàn)熒光PCR 技術(shù)應(yīng)用的另一個(gè)難點(diǎn)。
油脂中殘留的核酸特點(diǎn)是含量低、片段小和特異性不明。
設(shè)計(jì)時(shí)應(yīng)根據(jù)各物種的特征, 尋找保守區(qū)間且基因片段較
短。通過(guò)對(duì)本文引用的引物對(duì)做了統(tǒng)計(jì)歸納, 植物基因擴(kuò)
增產(chǎn)物片段分布表見圖1, 常用油料作物的引物見表1, 其
中涵蓋了大豆、花生、油菜籽、棕櫚、芝麻、棉花、玉米、
橄欖和葵花籽等常用油料作物。常用植物內(nèi)參基因如表2
所示。為了檢測(cè)轉(zhuǎn)基因原料使用情況, 還設(shè)計(jì)了專門針對(duì)
油料作物的引物以及其內(nèi)參基因(表3)。為了檢測(cè)食用油脂
中可能添加的動(dòng)物源性油脂, 設(shè)計(jì)了專門針對(duì)動(dòng)物油脂檢
測(cè)的引物及內(nèi)參基因(表4)。
圖1 植物基因擴(kuò)增產(chǎn)物片段分布
Fig. 1 Fragment distribution of amplified plant genes
萬(wàn)方數(shù)據(jù)
第2 期 劉鵬飛, 等: 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)在食用油脂檢測(cè)中的應(yīng)用 527
表1 常用油料作物的引物
Table 1 Primers for regular oil-bearing crops
NCBI 序列號(hào) 上游引物(5'-3') 下游引物(5'-3') 擴(kuò)增產(chǎn)物
(bp)
來(lái)源
大豆
XM_003518752.2 GCCCTCTACTCCACCCCCATCC GCCCATCTGCAAGCCTTTTTGTG 118 [20]
XM_003518752.2 GCCCATCTGCAAGCCTTTTT GCCGAAGCAACCAAACATG 294 [21]
XM_003518752.2 GATGGATCTGATAGAATTGAC CTCTACTCCACCCCCATC 233 [21]
XM_003518752.2 TCGCCGCTTCCTTCAACTT GCCCATCTGCAAGCCTTTTT 77 [21]
花生
HQ439774.1 GGTGCCAACACAAACTCCAAC GTTACTCCCATAGCCAATCTTCAA 81 [20]
FJ713110.1 GCAACAGGAGCAACAGTTCAAG CGCTGTGGTGCCCTAAGG 72 [22]
TCAGAATCCCATCCGGTTTC GTGTTAACGCGCATGGAGAT 91 [23]
油菜籽
D13987.1 CCAGTTCTTGGAGCCGCTTGA AAGGGCCAGTCCAAATGCAGA 121 [20]
AF127919.1 GGTCGTCCTCCTAAGGCGAAAG CTTCTTCGGCGGTCGTCCAC 99 [24]
X77576.1 GGTGAGCTGTATAATCGAGCGA GGCGCAGCATCGGCT 104 GB/T
19495.5-2004[25]
棕櫚 AJ236914.1 AGGGCAATTCCTAATGTATTGGAC CGCAGTTAGAGCCGCATTT 109 [20]
芝麻
AF240005.1 CCAGAGGGCTAGGGACCTTC CTCGGAATTGGCATTGCTG 62 SN/T1961.12-201
3[26]
AF240005.1 TTACCAGAGGGCTAGGGACCTT AACTCGGAATTGGCATTGCT 66 [21]
棉花 CGTGGCCTCGCGATCTGA
CTTCCATGCCGCCTCACAAG
CTCAGCGGCGGAGCTACAG
ACCCAGCCCTCCAAAGATT 89 SN/T3577-2013[27]
玉米
JQ083080.1 TGAACCCATGCATGCAGT GGCAAGACCATTGGTGA 190 SN/T
1203-2010[17]
BT065903.1 CGGTGGATGCTAAGGCTGATG AAAGGGCCAGGTTCATTATCCTC 88 [21]
AJ131373.1 TTGGACTAGAAATCTCGTGCTGA GCTACATAGGGAGCCTTGTCCT 79 GB/T19495.5-2004
BT065903.1 CTCCCAATCCTTTGACATCTGC TCGATTTCTCTCTTGGTGACAGG 151 GB/T19495.5-2004
橄欖
JF738736.1 AATCTTCTACTGGTACATGGAC AGTAACAGAACCCTCTTCAAAT 164
ACTCGCACACACTCCCTTTCC TTTTTAGCTCACTGGCCATCC 115 [28]
AJ001766 GGTGTTATTCCCGTGGCTTCAG ACGGAATCATCCCCAAAGATCTC 80 [29]
AJ001766 AAAGGGCGATGCTACCATATTGA GGGATTCGCAGATCTTCCAGAC 182 [29]
AJ416321 GTTCGCCAAAAGGACCGACAT GCCAGACATGGTGCAGCAGTT 82 [29]
AJ416321 TACACCACGGTCATGCAAGTCC TGGCGAACAGAAGACCGATAATG 193 [29]
葵花籽 CTCGAGCACCTCCGGCT GGATTGGATGGCATTCGG 60 [21]
表2 植物內(nèi)參基因引物
Table 2 Primers for plant housekeeping genes
NCBI 序號(hào) 上游引物(5'-3') 下游引物(5'-3') 擴(kuò)增長(zhǎng)度(bp) 來(lái)源
HM850302.1 AATGAAGGACGTGATCTTGC AGTTCAGGACTCCATTTGC 71 [30]
AB861614.1 TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT 137 [31]
KF600709.1 CGAAATCGGTAGACGCTACG TTCCTAAGAGTCTCTGCACCT 199 SN/T1204-2003[32]
萬(wàn)方數(shù)據(jù)
528 食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào) 第8 卷
表3 植物中轉(zhuǎn)基因成分引物
Table 3 Primers for transgenic ingredients
上游引物(5'-3') 下游引物(5'-3') 擴(kuò)增產(chǎn)物(bp) 來(lái)源
大豆
CCGACGCCGATCACCTA GATGCCGGGCGTGTTGAG 87 SN/T 1204-2003
CATTTGGAGAGGACACGCTGA GAGCCATGTTGTTAATTTGTGCC 74 GB/T19495.5-2004
CCTTTAGGATTTCAGCATCAGTGG GACTTGTCGCCGGGAATG 121 GB/T19495.5-2004
TAGCATCTACATATAGCTTC GACCAGGCCATTCGCCTCA 85 GB/T19495.5-2004
TCATCCCTTACGTCAGTGAG CCATCATTGCGATAAAGGAAA 165 專利201010596930.X[33]
油菜籽 GTCTTCGTGTTGCTGGAACCGTT GAACTGGCAGGAGCGAGAGCT 121 GB/T 19495.5-2004
棉花
CGTGGCCTCGCGATCTGACT
AAGATGCCTCTGCCGACAGT
CTCAGCGGCGGAGCTACAGA
GCGAAGGATAGTGGGATTGT 196 SN/T3577-2013
CGTGGCCTCGCGATCTGACT
TGAATCCTGTTGCCGGTCTT
CTCAGCGGCGGAGCTACAGACG
TATTAAATGTATAATTGCGGGA 184 SN/T3577-2013
CGTGGCCTCGCGATCTGACT
GAGTCCGTGGATGCTTTGTTC
CTCAGCGGCGGAGCTACAGA
ATCATGGCGATGTTGGTGTC 111 SN/T3577-2013
CGTGGCCTCGCGATCTGACTCC
AATACAGTTCCAGCTACAGCTA
CTCAGCGGCGGAGCTACAGA
CACCCACGATGTTACCGAGT 151 SN/T3577-2013
CGTGGCCTCGCGATCTGACTT
TGAAATTAAAAACCAATGCCAC
CTCAGCGGCGGAGCTACAGAGA
TGTTAGTTTCCCATTCGAGTTT 133 SN/T3577-2013
CGTGGCCTCGCGATCTGACTGG
CTAACATAAGTAGCTGTGAGTGA
CTCAGCGCCGGAGCTACAGA
AGATTGTCGTTTCCCGCCT 194 SN/T3577-2013
CGTGGCCTCGCGATCTGACTT
GTCATCTATGTTACTAGATCGGGG
CTCAGCGGCGGAGCTACAGAG
CCGAACGCTGTTATCCTCAT 206 SN/T3577-2013
玉米
CGCGACTGGATCAGGTACA TGGGGAACAGGCTCACGAT 76 SN/T 1204-2003
TCGAAGGACGAAGGACTCTAACG GCCACCTTCCTTTTCCACTATCTT 92 GB/T19495.5-2004
GATGCCTTCTCCCTAGTGTTGA GGATGCACTCGTTGATGTTTG 113 GB/T19495.5-2004
CCCATCGACATCAGCCTGAGC CAGGAAGGCGTCCCACTGGC 129 GB/T19495.5-2004
TGTTCACCAGCAGCAACCAG ACTCCACTTTGTGCAGAACAGATCT 100 GB/T19495.5-2004
AAAAGACCACAACAAGCCGC CAATGCGTTCTCCACCAAGTACT 127 GB/T19495.5-2004
GAAGCCTCGGCAACGTCA ATCCGGTTGGAAAGCGACTT 133 GB/T19495.5-2004
GCCAGTTAGGCCAGTTACCCA TGAGCGAAACCCTATAAGAACCCT 149 GB/T19495.5-2004
AGGATCTCGTCGTGACCCAT GCACGAGGAAGCGGTCA 183 SN/T1204-2003
ACAAGCACGGTCAACTTCC ACTCGGCCGTCCAGTCGTA 175 SN/T1203-2010
內(nèi)參基因 GTCTACATGTCTCCGGAGAG GCAACCAACCAAGGGTATG 191 SN/T1203-2010
引物 ATCGTTCAAACATTTGGCA ATTGCGGGACTCTAATCATA 165 SN/T1203-2010
CGACAGTGGTCCCAAAGA AAGACGTGGTTGGAACGTCTTC 74 SN/T1203-2010
萬(wàn)方數(shù)據(jù)
第2 期 劉鵬飛, 等: 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)在食用油脂檢測(cè)中的應(yīng)用 529
表4 動(dòng)物源性引物
Table 4 Primers for animal ingredients
名稱 上游引物(5'-3') 下游引物(5'-3') 擴(kuò)增產(chǎn)物
(bp)
來(lái)源
牛β2m CTGCTATGTGTATGGGTTCC GTAGAAAGACCAGTCCTTGC 115 SN/T3496-2013[34]
豬β2m GAAGGTTCAGGTTTACTCACG TCAGCAAATCAATTTCAATCTGG 107 SN/T3496-2013
羊線粒體 TTTCGCCTTTCACTTTATTTTCCC GGGTTGTTGGATCCTGTTTCG 90 SN/T3496-2013
MGH 牛生長(zhǎng)激素基因 CCTCAGACGGGTCTTCACCA CGTGTCAGGATTGGGTAAT SN/T2557-2010[35]
BGH 牛生長(zhǎng)激素基因 CCGATGGATGTGTTCAGAGCT GCCAAATGTCTGGGTGTAGATACC SN/T2557-2010
牛源性 CAACAGGAATCTCCTCAGACGTAGA GCTAGAATTAGTAAGAGGGCCCCTAA 91 [36]
HOXC5 基因 CGTAGCCAATTCATTCTATA TGGGAAAGTGATGCTTAA 138 [37]
SV40polyA 猿猴空泡病毒 TCACAAATTTCACAAATAAAGC ACATGATAAGATACATTGATGAG 82 SN/T3496-2013
NPTⅡ新霉素-3,-
磷酸轉(zhuǎn)移酶基因
TATGACTGGGCACAACAGAC CGTCTTGCAGTTCATTCAGG 124 SN/T3496-2013
CMV 啟動(dòng)子 GTTCCGCGTTACATAACTTACGG AAGTCCCTATTGGCGTTACTATGG 113 SN/T3496-2013
GFP 綠色熒光蛋白 AACCGCATCGAGCTGAAG GTTGTGGCGGATCTTGAAG 150 SN/T3496-2013
內(nèi)參基因引物
AAGACGAGAAGACCCTTGGACTTTA GATTGCGCTGTTATCCCTAGGGTA 234～262 [38]
AGGGATAACAGCGCAAT GTTCTTGAACTCAGATCACGTAGGACT 149 [39]
引物長(zhǎng)度一般在20～30 bp, 擴(kuò)增產(chǎn)物在50～300 bp。
如圖1 所示, 擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多集中于50～150 bp, 更多的在
100 bp 左右, 用于臨床檢測(cè)的引物產(chǎn)生的片段都大于200
bp[18,19]。這說(shuō)明經(jīng)過(guò)多重精煉工藝加工的油脂中所含的基
因破壞程度高, 與其他熒光PCR 技術(shù)應(yīng)用對(duì)象相比, 基因
模板片段更短, 但結(jié)構(gòu)穩(wěn)定, 最終被保留于油脂中, 可作
為PCR 應(yīng)用依據(jù)。
通常熒光定量PCR 的反應(yīng)程序需經(jīng)過(guò)94 ℃預(yù)變性5
min 后, 94 ℃ 30 s; 50 ℃ 60 s; 72 ℃ 40 s; 運(yùn)行40 個(gè)循環(huán),
72 ℃延伸5 min。退火溫度是反應(yīng)過(guò)程至為重要的環(huán)節(jié), 合
適的退火溫度可保證模板不斷增量, 產(chǎn)生熒光值, 因此本
文對(duì)比了植物物種與其他物種的退火溫度, 為將來(lái)實(shí)時(shí)熒
光PCR 應(yīng)用于油脂檢測(cè)提供參考依據(jù), 見圖2。
圖2 退火溫度對(duì)比
Fig. 2 Comparison of annealing temperature
(系列1: 其他物種退火溫度; 系列2: 植物物種退火溫度; 圖中樣
本選自本文列出的引物反應(yīng)條件。)
分別列取了10 種植物物種和其他物種的退火溫度,
從圖線趨勢(shì)看出, 大部分退火溫度在60 ℃附近, 系列2 曲
線位于系列1 下方, 表現(xiàn)出溫度降低, 這是由于相應(yīng)的降
低退火溫度可增加擴(kuò)增產(chǎn)量, 而油脂中殘留的DNA 模板
整體質(zhì)量不高, 適當(dāng)?shù)臏p低退火溫度利于熒光值產(chǎn)生, 但
過(guò)度降低會(huì)造成非特異性擴(kuò)增, 使結(jié)果呈現(xiàn)假陽(yáng)性。因此
在引物設(shè)計(jì)時(shí), 保證引物長(zhǎng)度在25 bp, 擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度在
100 bp, 退火溫度在55～60 ℃, 可有效達(dá)到擴(kuò)增目的。
4 熒光定量PCR 在油脂檢測(cè)中的具體應(yīng)用
4.1 油脂中動(dòng)物成分檢測(cè)
在檢測(cè)植物油脂中的動(dòng)物源成分時(shí), 王立平等[40]建
立的方法可有效檢測(cè)豬油-大豆油(質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%)中的豬油
成分, 并確定提取液選擇TE 緩沖液, 振搖時(shí)間不得低于
10 min, 要求油樣體積至少20 mL。范麗麗等[36]建立了對(duì)
市售產(chǎn)品中牛源性成分的檢測(cè)方法, 其熒光探針法檢測(cè)體
系的檢測(cè)限低至0.5%, 可檢測(cè)1 pg 牛源DNA 的存在, 設(shè)
計(jì)引物的擴(kuò)增片段為91 bp, 可為油脂中動(dòng)物成分檢測(cè)提
供依據(jù)。
4.2 油脂中轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)
在油脂中檢測(cè)轉(zhuǎn)基因成分時(shí), 傳統(tǒng)方法采用CTAB、
SDS 裂解液預(yù)處理油樣, 水相提取液水浴65 ℃、30 min
萬(wàn)方數(shù)據(jù)
530 食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào) 第8 卷
后加入沉淀劑。聞偉剛等[41]建立的DNA 提取方法和試劑
盒提取效果相當(dāng), 最終經(jīng)過(guò)PCR 鑒定, 檢測(cè)出每毫升大豆
原油中的核酸含量為2×10-5 ng。但試劑盒價(jià)格較高, 不利
于基層檢測(cè)工作開展。陳穎等[42]通過(guò)模擬轉(zhuǎn)基因食用油,
分別提取轉(zhuǎn)基因大豆和非轉(zhuǎn)基因大豆的DNA 添加于大豆
油中, 建立的方法可檢測(cè)出0.01%的轉(zhuǎn)基因成分。
4.3 植物油脂中其他類植物油脂成分檢測(cè)
周慧等[43]利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 方法檢測(cè)花生油中
摻入的棕櫚油成分, SN/T 1203-2010 提取油脂中DNA, 當(dāng)
摻入的棕櫚含量達(dá)到5%時(shí), 花生油中檢出棕櫚成分
17.431 copies/mL, 含量在3.19 ng 左右。此方法將棕櫚中
提取的核酸混入到花生油中, 模板破壞程度低, 不能完全
模擬棕櫚油, 但在實(shí)際運(yùn)用中可將此法作為參考。油脂制
備原料狀態(tài)對(duì)熒光檢測(cè)結(jié)果的靈敏度也有影響, 以花生為
例, 經(jīng)過(guò)部分脫水后的花生其核酸提取率要高于生花生,
同理通過(guò)冷榨技術(shù)或浸提法的花生油其核酸殘留量低, 實(shí)
驗(yàn)?zāi)M當(dāng)大豆油中的花生油含量低于20%時(shí)便不能被檢出
混入的花生成分[23]。
5 結(jié)果分析
5.1 樣品處理?xiàng)l件確定
實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)用于食用油脂成分檢測(cè)為油
脂品控提供了參考依據(jù)。改良CTAB 法對(duì)油脂中DNA 的
提取效果較好, 以CTAB 緩沖液為提取液, 油樣體積不少
于20 mL, 每次振搖時(shí)間不少于10 min, 高速離心使得
DNA 溶解于水相后, 冷凍過(guò)夜并結(jié)合DNA 提取試劑盒進(jìn)
行DNA 純化, 離心過(guò)柱濃縮DNA 提取液。通常認(rèn)為, 提
取液體積越大, 油樣越多, 提取到DNA 的可能性就越高。
但當(dāng)提取液體積大于10 mL 時(shí), 過(guò)離心柱(約1 mL 容量)
的次數(shù)增加, 耗時(shí)也相應(yīng)增加, 往往會(huì)造成DNA 損失; 而
減少提取液體積, 多次混合振蕩后, 離心分層后水相會(huì)伴
隨油樣被吸出, 最終的提取液中所溶解的DNA 量會(huì)有所
降低。對(duì)于水油混合可采用搖床振蕩和磁力攪拌的方法,
促進(jìn)油脂中DNA 溶于提取液。精煉食用油500 mL, 用
1000 mL PBS 緩沖液可提取出0.4 μg DNA[44]。
5.2 引物設(shè)計(jì)
根據(jù)已報(bào)道的NCBI 號(hào), 可查找相應(yīng)的基因序列, 通
過(guò)設(shè)定條件產(chǎn)生的引物序列可能被PCR 所用。設(shè)計(jì)引物堿
基數(shù)不宜過(guò)多, 避免引物二聚體產(chǎn)生, 擴(kuò)增產(chǎn)物不宜過(guò)小,
否則易產(chǎn)生假陽(yáng)性。根據(jù)油脂DNA 的特點(diǎn), 為了達(dá)到良好
PCR 擴(kuò)增效果, 引物設(shè)計(jì)長(zhǎng)度應(yīng)在25 bp, 產(chǎn)物大小為100
bp, 設(shè)定退火溫度為55～60 ℃。
5.3 結(jié)果判斷
與傳統(tǒng)PCR 技術(shù)相比, 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)具有
特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確、PCR 污染少和自動(dòng)化程
度高等優(yōu)點(diǎn)[45]。整個(gè)PCR 過(guò)程可通過(guò)擴(kuò)增曲線實(shí)時(shí)監(jiān)控,
產(chǎn)物量的對(duì)數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系, 可實(shí)現(xiàn)
定量分析。
常規(guī)PCR 以電泳結(jié)果為準(zhǔn), 將擴(kuò)增條帶與DNA
Marker 分子量標(biāo)準(zhǔn)對(duì)比, 一般認(rèn)為在對(duì)應(yīng)的分子量區(qū)有條
帶產(chǎn)生, 則說(shuō)明擴(kuò)增成功。熒光定量PCR 技術(shù)以擴(kuò)增曲線
為判斷準(zhǔn)則, 可進(jìn)行絕對(duì)定量和相對(duì)定量。絕對(duì)定量可準(zhǔn)
確測(cè)出DNA含量, 判斷結(jié)果準(zhǔn)確, 而相對(duì)定量法中主要以
Ct 值判斷, 通常當(dāng)Ct＞40 時(shí), 結(jié)果為陰性; Ct 值＜36 時(shí),
結(jié)果為陽(yáng)性; 36＜Ct＜40 時(shí), 實(shí)驗(yàn)應(yīng)重復(fù)后再判斷結(jié)果。無(wú)
論是絕對(duì)定量還是相對(duì)定量, 直觀的曲線信息可減少實(shí)驗(yàn)
誤差。常用的熒光定量PCR 方法主要有染料法和探針法。
在染料法中, 熒光染料不存在特異性, 僅識(shí)別DNA分子中
雙鍵, 對(duì)產(chǎn)生的二聚體等非特異性產(chǎn)物也有熒光信號(hào), 結(jié)
果易有假陽(yáng)性; 而探針法中所設(shè)計(jì)的核酸探針僅特異性擴(kuò)
增某段區(qū)域, 其結(jié)果更為可靠。目前國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中也多采用
探針法進(jìn)行定量。
6 總 結(jié)
食用油脂中核酸片段小、純度低, 但經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期試驗(yàn)證
明熒光定量PCR 技術(shù)可實(shí)現(xiàn)油脂品質(zhì)控制, 尤其是食用原
油?，F(xiàn)已建立的油脂DNA 提取方法使DNA 質(zhì)量在pg 級(jí)
也可滿足熒光定量PCR 的要求; 但在DNA 提取中存在著
影響PCR 過(guò)程的因素如酚類、醇類等殘留, 應(yīng)充分除去以
確保DNA 純度。此外, 對(duì)于精煉程度高的油脂需要大量原
料富集, 且提取液的量也會(huì)相應(yīng)增加, 適當(dāng)次數(shù)的離心過(guò)
柱可有效提取其中的核酸, 應(yīng)設(shè)計(jì)較大容量的離心柱。同
時(shí)合適的引物也是PCR 過(guò)程必不可少的。不少植物物種已
經(jīng)公布全序列基因信息, 可選擇代表物種屬性且穩(wěn)定性高
的基因區(qū)間作為設(shè)計(jì)引物依據(jù), 引物不宜過(guò)長(zhǎng), 避免二聚
體產(chǎn)生, 同時(shí)不斷豐富引物信息, 真正實(shí)現(xiàn)采用熒光定量
PCR 技術(shù)對(duì)食用油脂的安全監(jiān)控。
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(責(zé)任編輯: 姚 菲)
作者簡(jiǎn)介
劉鵬飛, 碩士研究生, 學(xué)士, 主要研究
方向?yàn)槭称钒踩珯z測(cè)技術(shù)、天然活性物質(zhì)。
E-mail: 1163245636 @qq.com
李 健, 副教授, 主要研究方向?yàn)?
食品安全、食品生物技術(shù)、天然化合物。
E-mail: lijian2013@jmu.edu.cn.

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