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《保健食品檢驗與評價技術規(guī)范》中肉堿含量測定方法適用性的探討

文檔作者：潘小紅, 李濤, 楊慶懿, 林海文檔來源：湖南省食品藥品檢驗研究院		點擊數(shù)：	更新時間： 2025年06月27日
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第6 卷 第10 期 食品安全質(zhì)量檢測學報 Vol. 6 No. 10
2015 年10 月 Journal of Food Safety and Quality Oct. , 2015
基金項目: 湖南省自然科學基金(2015JJ6121)
Fund: Supported by the Natural Science Foundation of Hunan Province (2015JJ6121)
*通訊作者: 林海, 研究員, 主要研究方向為天然藥物化學、藥物制劑研發(fā)。E-mail: 462762014@qq.com
*Corresponding author: LIN-Hai, Researcher, Hunan Institute for Food and Drug Control, No. 60, Bayi Road, Furong District, Changsha
410001, China. E-mail: 462762014@qq.com
《保健食品檢驗與評價技術規(guī)范》中肉堿含量
測定方法適用性的探討
潘小紅, 李 濤, 楊慶懿, 林 海*
(湖南省食品藥品檢驗研究院, 長沙 410001)
摘要: 目的對《保健食品檢驗與評價技術規(guī)范》(2003 年版)肉堿含量測定的高效液相色譜法進行適用性研
究。方法 通過對檢測波長、色譜柱、流動相比例等色譜條件, 提取劑、提取溫度及提取時間等提取條件的試
驗研究, 探討不同提取方法及色譜條件對檢驗結(jié)果的影響。結(jié)果以純化水為提取劑、30 ℃超聲20 min, 采
用色譜柱Phenomenex Gemini C18, 流動相 pH 2.5 0.05 mol/L 磷酸氫二鉀:0.002 mol/L 辛烷磺酸鈉:乙腈(52:45:3),
檢測波長210 nm, 0.8 mL/min, 肉堿濃度在47.86~2390 μg/mL 范內(nèi)呈良好的線性關系, (r2=1.0000), 平均回收率
為101.58%, RSD 值為1.46%。結(jié)論 該方法簡化了提取劑配制步驟, 優(yōu)化了流動相的比例, 改善了色譜柱的專
屬性, 該試驗條件適用于不同產(chǎn)品中左旋肉堿含量的測定, 可提高肉堿質(zhì)量標準的實驗操作性。
關鍵詞: 肉堿; 高效液相色譜法; 檢測方法研究
Discussion of applicability of L-carnitine content in the technical specification
for inspection and evaluation of health food
PAN Xiao-Hong, LI Tao, YANG Qing-Yi, LIN Hai*
(Hunan Institute for Food and Drug Control, Changsha 410001, China)
ABSTRACT: Objective To study the method for determination of L-carnitine content by high performance
liquid chromatography (HPLC) in the Technical Specification for Inspection and Evaluation of Health Food.
Methods The effects of different extractants and chromatographic conditions on the results of the test were
discussed by extraction conditions such as extractant, extraction temperature and extraction time, detection
wavelength, chromatographic column, and mobile phase ratio. Results The samples were extracted by
ultrasonic extraction with pure water as extractant, under 30 ℃ and 20 min extraction condition. The
separations was performed on a Phenomenex Gemini C18 column (4.6 mm×150 mm, 5 μm), the dipotassium
phosphate (pH 2.5 0.005 mol/L):octane sulfonate (0.002 mol/L):acetonitrile was 52:45:3 , the flow rate was 0.8
mL/min, and the detection wavelength was 210 nm. The L-camitine showed a good linearity in the range of
47.86~2390 μg/mL (r2=1.0000). The average recovery and relative standard deviation (RSD) were 101.58%
and 1.46%, respectively. Conclusion the extractant preparation was simplified, the proportion of mobile
phase was optimized, and the specificity of the chromatographic column was improved, and the test condition
was suitable for the determination of L-carnitine in different products to improve experimental operability of
第10 期 潘小紅, 等: 《保健食品檢驗與評價技術規(guī)范》中肉堿含量測定方法適用性的探討 4263
the carnitine quality standards.
KEY WORDS: L-camitine; high performance liquid chromatography; detection methods studies
1 引 言
左旋肉堿具有減少脂肪、促進疲勞恢復、減慢人
體衰老等功能, 人體若缺乏左旋肉堿將干擾脂肪酸
的代謝而導致能量合成不足, 易出現(xiàn)疲勞、肌肉無
力、心慌等癥狀, 因此, 左旋肉堿作為食品營養(yǎng)強化
劑廣泛應用于奶粉(包含兒童乳粉)、飲料等食品中。
市面上宣稱含左旋肉堿的保健食品品種很多, 數(shù)量
繁雜。據(jù)不完全統(tǒng)計, 我國減肥類保健食品, 每年以
超過20%的速度激增, 年銷售總額可達上百億, 已經(jīng)
成為保健食品市場中第二大類別[1-7]。
我國左旋肉堿測定的現(xiàn)有國家檢測標準主要有
《GB17787-1999 食品添加劑 左旋肉堿》容量分析
法、《GB 29989-2013 食品安全國家標準嬰幼兒食品
和乳品中左旋肉堿的測定》紫外分析法, 《保健食品
檢驗與評價技術規(guī)范(2003 年版)》中的高效液色譜法,
參考文獻報道主要有容量分析法、高效液相色譜法、
液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法、離子色譜法等, 但試驗過程中
發(fā)現(xiàn), 容量分析法干擾大, 液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法、離
子色譜法儀器要求較高[8-15], 因此, 本實驗對《保健
食品檢驗與評價技術規(guī)范(2003 年版)》中左旋肉堿的
高效液相色譜法進行探討, 通過對左旋肉堿提取條
件及色譜條件的實驗研究, 簡化了提取劑配制步驟,
優(yōu)化了流動相的比例, 選擇肉堿的專屬色譜柱, 擴大
標準的適用范圍, 結(jié)果表明, 該試驗條件適用于不同
產(chǎn)品中左旋肉堿含量的測定。
2 材料與方法
2.1 實驗材料
2.1.1 試驗原料
藥店、超市、專柜購買宣稱含左旋肉堿的保健
食品。
2.1.2 儀器與試劑
高效液相色譜儀(Agilent 1260 Infinity, 美國安捷倫
公司); 紫外可見分光光度計(UV-2550, 日本SHIMADZU
公司); 超聲波清洗器(SBZS-12D, SCIENTZ); 電子分
析天(TB-215D, 美國DENVER 公司)。
左旋肉堿標準品: 德國Dr. Ehrenstorfer, 批
號:00506, 含量99.0%。
2.2 實驗方法
2.2.1 色譜條件的選擇
色譜柱: CAPCELL PAK CR (4.6 mm×250 mm, 5
μm) 、Nucleosil C18 (4.6 mm×250 mm, 5 μm) 、
Phenomenex Gemini C18 (4.6 mm×250 mm, 5 μm); 流
動相: 0.05 mol/L 磷酸氫二鈉溶液(pH=2.5):0.002
mol/L 辛烷磺酸鈉:乙腈; 流速: 0.8 mL/min; 掃描波
長: 190 nm~400 nm; 檢測波長: 210 nm; 柱溫: 30 ℃;
進樣量: 5~10 μL。
2.2.2 提取條件的選擇
對不同提取方法、提取劑、提取溫度和提取時間
進行單因素試驗研究, 選取提取pH(3、4、純化水), 提
取溫度(20、30、40 ℃)及超聲時間(10、15、20 min)
為正交實驗的3 因素3 水平, 選用L9(34)正交表進行
組合試驗, 利用正交設計助手II V3.1 進行結(jié)果分析,
確定左旋肉堿最佳提取條件, 詳見表1。
2.2.3 樣品測定
準確稱取粉碎并混合均勻的樣品約0.50 g 于100
mL 具塞三角瓶中, 加入 50.00 mL 純化水, 30 ℃ 超
聲提取20 min, 混勻, 過0.45 μm 濾膜, 供HPLC 分
析用。
3 結(jié)果與分析
3.1 色譜條件的選擇
3.1.1 檢測波長的選擇
左旋肉堿標準溶液在190~400 nm 波長范圍內(nèi)光
譜掃描圖見圖1, 結(jié)果表明左旋肉堿的最大吸收波長
為193 nm。
考慮到左旋肉堿在低波長200 nm 左右干擾較多
[13], 為保證檢測方法的靈敏度及準確度, 本實驗參
考《保健食品檢驗與評價技術規(guī)范》(2003 年版), 選
用210 nm 為檢測波長。
3.1.2 色譜柱的選擇
左旋肉堿對色譜柱的要求較專一, 本實驗選用
《保健食品檢驗與評價技術規(guī)范》(2003 年版)及參考
文獻報道的幾款色譜柱, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)Phenomenex
Gemini C18 色譜柱能將左旋肉堿很好的分離, 出峰時
4264 食品安全質(zhì)量檢測學報 第6 卷
表1 實驗因素水平表
Table 1 Level of experimental factors
試驗號 提取溫度℃ 提取PH 超聲時間(min) 空列
1 20 3 10 Ⅰ
2 20 4 15 Ⅱ
3 20 純化水 20 Ⅲ
4 30 3 15 Ⅲ
5 30 4 20 Ⅰ
6 30 純化水 10 Ⅱ
7 40 3 20 Ⅱ
8 40 4 10 Ⅲ
9 40 純化水 15 Ⅰ
圖1 左旋肉堿標準溶液光譜圖
Fig. 1 The spectra of L-carnitine standard solution
間較合適, 說明Phenomenex Gemini C18 色譜柱在合
適的離子濃度和酸度的流動相中, 對左旋肉堿有很
好的保留和分離, 因此, 選擇Phenomenex Gemini
C18 色譜柱, 圖2 為使用Phenomenex Gemini C18 色譜
柱時左旋肉堿標準溶液的色譜圖[14-18]。
3.1.3 流動相及流動相比例的確定
流動相酸度越大, 左旋肉堿的保留時間越長。
同時, 流動相的離子強度越強, 流動相的洗脫能力
越強, 即保留時間越短。實驗發(fā)現(xiàn), 流動相中離子濃
度及酸的強度對左旋肉堿分離影響非常大, 尤其是
樣品中雜質(zhì)與標準的分離。因此, 選擇pH 2.5 的0.05
mol/L 磷酸氫二鉀溶液, 0.002 mol/L 辛烷磺酸鈉溶
液分別單獨配制于獨立泵中, 通過對流動相的不同
比例進行比較分析, 最終選擇磷酸氫二鉀:辛烷磺酸
鈉:乙腈=52:45:3。在該流動相比例下, 分離效果最
佳, 左旋肉堿沒有受到其他雜質(zhì)的干擾。另一方面,
因人工配制試劑存在誤差會影響分離效果, 應將3
種流動相溶液單獨配制, 分別存放, 在樣品分析時,
方便調(diào)節(jié)各流動相的比例, 可以有效分離左旋肉堿
與雜質(zhì)。
3.2 提取條件的選擇
3.2.1 提取方法的選擇
據(jù)文獻報道, 左旋肉堿在pH 值為3~6 的溶液中
穩(wěn)定儲存1 年以上, 能耐200 ℃以上的高溫, 具有較
好的溶水性和吸水性[7]。本試驗采用超聲、索氏抽提、
加熱回流等不同提取方法、不同酸度的提取溶劑、提
取溫度進行研究, 實驗結(jié)果表明: 提取溫度從
10~30℃時, 左旋肉堿含量逐漸升高; 然而當溫度≥
40 ℃時, 隨著提取溫度升高, 左旋肉堿含量相對變
化不大。超聲時間在5~30 min 范圍內(nèi), 隨著時間延
長, 提取效果增加, 此本試驗設立L9(34)正交試驗,
考察提取時間、溫度、pH 對提取結(jié)果的影響。正交
實驗的結(jié)果分析見表2, 效應曲線見圖3。
方差結(jié)果分析顯示, 提取溫度: K2＞K3＞K1; 提
取pH 因素: K3＞K2＞K1; 超聲時間因素: K3＞K1＞
K2。優(yōu)選組合為A2B3C3, 即最優(yōu)提取左旋肉堿條件是
提取溫度30 ℃、提取pH5、超聲時間為20 min。
3.3 方法學考察
3.3.1 線性結(jié)果分析
經(jīng)HPLC 分析后得到標準曲線見圖4。結(jié)果表明
該方法在47.86 μg/mL~2390.00 μg/mL 范圍內(nèi)呈線性
關系?；貧w方程為Y=19.1837X+0.4617, r2=1.0000。
第10 期 潘小紅, 等: 《保健食品檢驗與評價技術規(guī)范》中肉堿含量測定方法適用性的探討 4265
圖2 Phenomenex Gemini C18 色譜柱色譜圖
Fig. 2 Chromatogram of Phenomenex Gemini C18
表2 正交實驗方案以及結(jié)果分析
Table 2 Orthogonal test programs and results analysis
試驗號 A 提取溫度(℃) B 提取pH C 超聲時間(min) 空列 左旋肉堿含量(mg/100 g)
1 20 3 10 Ⅰ 721
2 20 4 15 Ⅱ 758
3 20 純化水 20 Ⅲ 954
4 30 3 15 Ⅲ 954
5 30 4 20 Ⅰ 1047
6 30 純化水 10 Ⅱ 1156
7 40 3 20 Ⅱ 917
8 40 4 10 Ⅲ 905
9 40 純化水 15 Ⅰ 1021
K1 811.000 864.000 927.333 929.667
K2 1052.333 903.333 911.000 943.667
K3 947.667 1043.667 972.667 937.3667
R 241.333 179.667 61.667 14.000
圖3 效應曲線圖
Fig. 3 Effect curve chart
4266 食品安全質(zhì)量檢測學報 第6 卷
圖4 左旋肉堿標準曲線
Fig. 4 Standard curve of L-carnitine
3.3.2 回收率考察
根據(jù)優(yōu)化的條件, 對其進行方法學考察, 精密
度RSD 值為1.18%。經(jīng)計算后得到平均回收率為
101.58%, RSD 值為1.46%。結(jié)果表明, 該方法可靠,
且在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。
3.4 樣品測定結(jié)果分析
根據(jù)優(yōu)化結(jié)果, 對市面上宣稱含有左旋肉堿的
樣品進行測定, 其中合格的樣品左旋肉堿含量與說
明書左旋肉堿標示的含量范圍基本一致, 圖5 為其中
2 批不同廠家的樣品色譜圖。
圖5 樣品色譜譜
Fig. 5 Chromatogram of samples
4 結(jié)論與討論
左旋肉堿是類維生素類營養(yǎng)素[7, 13], 同時是食
物的組成成分, 安全穩(wěn)定性好、保健功效明顯, 在食
品、保健品領域有著巨大的前景。本實驗主要對《保
健食品檢驗與評價技術規(guī)范(2003 年版)》中左旋肉堿
的高效液相色譜法進行適用性探討, 提出系統(tǒng)的最
佳條件為以純化水為提取劑、30 ℃超聲20 min, 采用
色譜柱Phenomenex Gemini C18, 流動相 pH2.5 0.05
mol/L 磷酸氫二鉀:0.002 mol/L 辛烷磺酸鈉:乙腈
(52:45:3), 簡化了提取劑配制步驟, 優(yōu)化流動相的比
例, 同時改善了色譜柱的專屬性, 此系統(tǒng)下, 肉堿濃
度在47.86 μg/mL~2390.00 μg/mL 范圍內(nèi)呈良好的線
性關系(r2=1.0000), 平均回收率為101.58%, RSD 值
為1.46%適用于不同廠家不同產(chǎn)品中肉堿含量的測
定, 提高了《保健食品檢驗與評價技術規(guī)范(2003 年
版)》肉堿測定的實驗操作性。
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(責任編輯: 李振飛)
作者簡介
潘小紅, 助理研究員, 主要研究方向
為食品、藥品、保健食品及化妝品的檢驗及
研發(fā)。
E-mail: panxiaohong56781@163.com
林 海, 研究員, 主要研究方向為天
然藥物化學、藥物制劑研發(fā)。
E-mail: 462762014@qq.com

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