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AlphaLISA技術(shù)在食品安全檢測(cè)中的研究進(jìn)展

文檔作者：洪小柳呂敬章張恒范放劉慧玲趙芳文檔來(lái)源：深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局,		點(diǎn) 擊數(shù)：	更新時(shí)間： 2025年06月08日
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上一篇： ATP生物發(fā)光法評(píng)價(jià)餐飲具的微生物污染研究

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第5 卷第 1 期食 品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào)Vol. 5 No. 1
2014 年1 月Journal of Food Safety and Quality Jan. , 2014
基金項(xiàng)目: 深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局科技項(xiàng)目(SZ2011001); 國(guó)家科技支撐計(jì)劃子課題(2012BA08B01-5)
Fund: Supported by Shenzhen CIQ Science &amp;amp; Technology Program (SZ2011001) and The national science and Technology Support Program
(2012BA08B01-5)
*通訊作者: 趙芳, 碩士, 工程師, 主要研究方向?yàn)槭称肺⑸锛矮F藥殘留檢測(cè)。E-mail: zf.ff@163.com
*Corresponding author: ZHAO Fang, Engineer, Shenzhen Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, No.1011, Fuqiang Road, Futian District,
Shenzhen 518045, China. E-mail: zf.f @163.com
AlphaLISA 技術(shù)在食品安全檢測(cè)中的研究進(jìn)展
洪小柳, 呂敬章, 張恒, 范放, 劉慧玲, 趙芳*
(深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局, 深圳 518045)
摘要: 納米均相時(shí)間分辨熒光免疫法(AlphaLISA)是一種基于納米微珠的光激化學(xué)發(fā)光的新型均相檢測(cè)技術(shù),
較傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)具有均相、免清洗、敏感度高、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)。本文介紹了AlphaLISA 的
原理和特點(diǎn), 簡(jiǎn)要總結(jié)了近年來(lái)國(guó)內(nèi)外AlphaLISA 技術(shù)的應(yīng)用研究, 重點(diǎn)綜述了食品安全領(lǐng)域(包括生物毒素和
藥物殘留)的研究進(jìn)展, 并對(duì)此技術(shù)的發(fā)展前景進(jìn)行了展望。
關(guān)鍵詞: 納米均相時(shí)間分辨熒光免疫法; 檢測(cè); 食品安全
Research progress of AlphaLISA technology in food safety detection
HONG Xiao-Liu, LV Jing-Zhang, ZHANG Heng, FAN Fang, LIU Hui-Ling, ZHAO Fang*
(Shenzhen Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Shenzhen 518045, China)
ABSTRACT: Homogeneous time-resolved fluoroimmunoassay (AlphaLISA) is a new homogeneous detection
technology based on light stimulating of the chemiluminescence of nano micro-bead. Compared with the traditional
ELISA, the AlphaLISA has characteristics of homogeneity, free of cleaning, high sensitivity and specificity.
This paper introduced the principles and characteristics of AlphaLISA, briefly summarized the application
research of AlphaLISA technology at home and abroad in recent years, reviewed the research progress of
food safety field (including biological toxins and drug residues), and the future development of this technology
was also prospected.
KEY WORDS: homogeneous time-resolved fluoroimmunoassay; detection; food safety
近年來(lái)食品安全問(wèn)題層出不窮, 食品安全的快
速檢測(cè)方法研究越來(lái)越受到人們的關(guān)注, 傳統(tǒng)的免
疫學(xué)檢測(cè)方法被廣泛應(yīng)用于食品安全檢測(cè)。光激化學(xué)
發(fā)光納米均相時(shí)間分辨熒光免疫法(AlphaLISA)技術(shù)
在分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域上得到廣泛應(yīng)用, 但在食
品安全檢測(cè)領(lǐng)域才剛剛起步。本文就目前AlphaLISA
技術(shù)在國(guó)內(nèi)外的研究應(yīng)用進(jìn)展作一綜述, 并且著重
對(duì)食品安全檢測(cè)應(yīng)用領(lǐng)域作出分析和展望。
1 光激化學(xué)發(fā)光技術(shù)的概述
納米均相熒光免疫 (luminescent oxygenchanneling
immunoassay, LOCI) 在1994 年最初由Ullman
等[1]報(bào)道, 以均相、一步、免清洗的操作優(yōu)勢(shì), 以高
靈敏度、特異性強(qiáng)和高通量的技術(shù)特點(diǎn), 成為近幾年
免疫研究分析的熱點(diǎn)。目前, 美國(guó)PerkinElmer 公司
已生產(chǎn)多種相關(guān)試劑(AlphaScreenTM)。AlphaLISA
第1 期洪小柳, 等: AlphaLISA 技術(shù)在食品安全檢測(cè)中的研究進(jìn)展 199
技術(shù)是由 AlphaScreen 發(fā)展而來(lái)的用于高通量篩選的
光激化學(xué)發(fā)光技術(shù)。
1.1 AlphaLISA 的原理
AlphaLISA 技術(shù)的核心原理是單體氧的產(chǎn)生和
傳遞(圖1)。AlphaLISA 檢測(cè)試劑盒中包含感光微粒
和發(fā)光微粒兩種微粒, 這兩種微粒直徑約為188 nm。
在兩種微粒表面覆蓋有一層水凝膠, 微粒通過(guò)水凝
膠表面的功能團(tuán)與生物分子相偶聯(lián)。每個(gè)微粒表面可
以覆蓋成百上千個(gè)生物分子, 可捕獲待測(cè)分子。當(dāng)兩
種微粒受到680 nm 的激光照射后, 感光微粒表面的
光敏劑就會(huì)將周?chē)h(huán)境中的氧氣轉(zhuǎn)化為單體氧。單體
氧的傳播直徑約為200 nm, 如果發(fā)光微粒與感光微
粒之間的距離小于200 nm, 單體氧就能擴(kuò)散至發(fā)光
微粒, 產(chǎn)生高能級(jí)的發(fā)光。相反, 如果發(fā)光微粒和感
光微粒的距離大于200 nm, 單體氧無(wú)法擴(kuò)散至發(fā)光
微粒, 就不會(huì)有光信號(hào)的產(chǎn)生。AlphaLISA 均相反應(yīng)
就是基于以上原理, 如果包被在兩種微粒表面的生
物分子存在相互作用時(shí), 就拉近了兩種微粒之間的
距離, 產(chǎn)生光信號(hào)。通過(guò)對(duì)光信號(hào)的強(qiáng)度檢測(cè), 來(lái)判
斷實(shí)際檢測(cè)樣品中有無(wú)待測(cè)目標(biāo)物。
1.2 AlphaLISA 技術(shù)的特點(diǎn)
AlphaLISA 技術(shù)與傳統(tǒng)ELISA 相比, 具有以下
多種優(yōu)勢(shì): ①靈敏度高。采用的是納米級(jí)微粒, 供體
微珠含有高密度的光敏劑, 增加了反應(yīng)表面積, 極大
地提高了檢測(cè)靈敏度, 靈敏度由ELISA 的10-10
mol/L[2]數(shù)量級(jí)提高到10-17 mol/L; ②均相反應(yīng)模式實(shí)
現(xiàn)了一步、免清洗檢測(cè)、操作簡(jiǎn)便、易于自動(dòng)化、2 h
內(nèi)完成整個(gè)實(shí)驗(yàn)流程; ③穩(wěn)定性好。AlphaLISA 長(zhǎng)波
長(zhǎng)激發(fā), 短波長(zhǎng)發(fā)射, 能完全避免反應(yīng)體系中的自發(fā)
光, 具有較強(qiáng)的抗淬滅能力, 檢測(cè)過(guò)程也不易受到樣
本組織干擾和pH 值、離子強(qiáng)度及溫度等因素干擾; ④
樣本用量少(低至5 μL 或更少), 更易實(shí)現(xiàn)小型化、芯
片化和高通量檢測(cè)[3]; ⑤用途廣泛, 可進(jìn)行多種形式
的實(shí)驗(yàn),包括競(jìng)爭(zhēng)性實(shí)驗(yàn)、結(jié)合實(shí)驗(yàn)、解聚實(shí)驗(yàn)、多
種生物性分子間的檢測(cè)等[4], 可以使用直接檢測(cè)的方
式, 也可以選擇間接檢測(cè)的方式。
2 國(guó)內(nèi)外的研究現(xiàn)狀和應(yīng)用
基于 AlphaLISA 技術(shù)的原理, 單體氧分子在溶
液中可擴(kuò)散200 nm, 供體微珠和受體微珠在小于200
nm 的范圍內(nèi)都可被檢測(cè)到。而其他均相技術(shù), 例如
時(shí)間分辨熒光(TR-FRET)、熒光偏振(FP), 供體和受
體之間的距離為10 nm, 僅限于小分子的檢測(cè)。
AlphaLISA 不受分子大小的影響, 可以應(yīng)用于酶活
性、受體配體反應(yīng)、DNA、RNA、蛋白、多肽、碳
水化合物等檢測(cè)[5-9]。近年來(lái), AlphaLISA 技術(shù)廣泛
應(yīng)用于多種組織、細(xì)胞來(lái)源的生物分子檢測(cè)、新藥物
開(kāi)發(fā)分析[10]和臨床醫(yī)學(xué)病原體檢驗(yàn)等領(lǐng)域。
2.1 分子生物檢測(cè)
Poulsen 等[4] 用AlphaLISA 和ELISA 兩種方法分
別定量人體血漿中的胰島素含量。結(jié)果顯示, 使用相
同的抗體條件下, 兩種方法的定量結(jié)果一致性非常
好。AlphaLISA 方法不受血紅素等樣品中其他成分干
擾, 比ELISA 具有更高的靈敏度和精確性,
圖 1 AlphaLISA 的技術(shù)原理[2]
Fig. 1 Principle of AlphaLISA
200 食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào)第 5 卷
只需要 ELISA1/5 的樣本量, 就能達(dá)到比ELISA 低15
倍的檢出限, 同時(shí)操作簡(jiǎn)便, 更易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。王柯
等[12] 應(yīng)用ELISA、TRFIA 以及AlphalISA 技術(shù)建立
了小鼠腫瘤壞死因子的檢測(cè)方法, 從反應(yīng)動(dòng)力學(xué)、方
法學(xué)參數(shù)、相關(guān)性等方面比較這三種方法, 結(jié)果顯示
三種方法的相關(guān)性非常好, 而AlphaLISA 技術(shù)由于
不需要洗板孵育的過(guò)程, 耗時(shí)短、靈敏度高, 最適合
痕量樣品的檢測(cè)。
2.2 新藥物開(kāi)發(fā)
在藥物研發(fā)過(guò)程中, AlphaLISA 技術(shù)對(duì)樣本的小
型化和高靈敏度特點(diǎn), 可以減少篩選成本、提高產(chǎn)量,
尤其對(duì)數(shù)量少又珍貴的樣本極其重要。
2012 年, Schneider 等[13]使用AlphaLISA 技術(shù)將
泛素化結(jié)合矩陣作為通用組件檢測(cè)泛素化蛋白。泛素
—蛋白酶體通路(UPP)是蛋白質(zhì)的選擇性降解中一項(xiàng)
非常重要的機(jī)制, 特別是在這個(gè)通路的E3 連接酶的
失調(diào)與多種疾病發(fā)生機(jī)理有關(guān), 如癌癥、炎癥和代謝
性疾病。E3 連接酶是一類(lèi)重要的藥物靶標(biāo), 傳統(tǒng)的
篩選技術(shù)通量低, 并多采用免疫印跡技術(shù)。
AlphaLISA 法結(jié)合生化檢測(cè)能識(shí)別出泛素化E3 連接
酶的抑制因子, 廢除發(fā)病機(jī)制。該方法未來(lái)在泛素的
藥物開(kāi)發(fā)和診斷上將有廣闊的應(yīng)用前景。
Beaudet 等[10]將生物素化的針對(duì)磷酸化的靶物質(zhì)
的抗體作為一抗, 二抗直接偶聯(lián)于受體微珠, 來(lái)分別
檢測(cè)未受刺激的細(xì)胞及用抗癌藥物治療的細(xì)胞內(nèi)靶
物質(zhì)的去磷酸化作用, 結(jié)果Z 值達(dá)到0.9。
2.3 病原體檢測(cè)
AlphaLISA 技術(shù)近兩年已在國(guó)內(nèi)被廣泛應(yīng)用于
乙肝病毒抗原抗體檢測(cè)和試劑盒研制。馬強(qiáng)等[14]應(yīng)
用AlphaLISA 法來(lái)定量出人血清乙型肝炎病毒e 抗
體(HBeAb)濃度, 檢測(cè)結(jié)果顯示自制試劑盒靈敏度為
0.003 NCU/mL, 可測(cè)范圍為0.003~16 NCU/mL, 136
份臨床血樣試劑盒測(cè)定數(shù)值有顯著相關(guān)性, R 值為
0.961。自制試劑盒的各項(xiàng)指標(biāo)能夠達(dá)到臨床檢測(cè)要
求, 可取代昂貴的進(jìn)口試劑盒應(yīng)用于臨床檢測(cè)和基
礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究。
陳桂蘭等[15]比較了AlphaLISA 法與電化學(xué)發(fā)光
免疫分析法(ECLIA)、ELISA 及膠體金法測(cè)定低濃度
HBsAg, 并評(píng)價(jià)AlphaLISA 測(cè)定HBsAg 的臨床效果。
結(jié)果表明, AlphaLISA 檢測(cè)HBsAg 與ECLIA 有很高
的符合率, 在低濃度的HBsAg 檢測(cè)中, 可最大程度
地減少假陰性結(jié)果, 大大優(yōu)于其他方法。由于
AlphaLISA已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了儀器和試劑的國(guó)產(chǎn)化, 成本較
低, 可以有效降低醫(yī)療費(fèi)用且該法可進(jìn)行自動(dòng)化定
量檢測(cè), 適于臨床使用。
在大量的可溶性抗原細(xì)菌和病毒的檢測(cè)基礎(chǔ)上,
Mechaly 等[16]首次報(bào)道了顆粒性抗原的檢測(cè), 即炭疽
芽孢桿菌孢子和保護(hù)性抗原(PA)在復(fù)雜樣品中的檢
測(cè)。為了避免供體珠聚集在孢子的表面上, 供體與受
體濃度比例應(yīng)該高于4:1。檢測(cè)靈敏度為106 孢子
/mL。兔血清中PA 的檢測(cè)范圍在10~100 pg/mL, 整
個(gè)檢測(cè)過(guò)程只需50 min。該研究為檢測(cè)其他顆粒性抗
原如細(xì)菌或病毒奠定了基礎(chǔ)。
3 AlphaLISA 技術(shù)在食品安全檢測(cè)中的研
究應(yīng)用
AlphaLISA 技術(shù)雖在國(guó)內(nèi)外已得到迅速的發(fā)展,
尤其在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域已廣泛應(yīng)用, 但在食品安全領(lǐng)域的
方法學(xué)研究和試劑盒研制方面的報(bào)道較少, 僅在生
物毒素和獸藥殘留上有報(bào)道。
3.1 食品中的毒素檢測(cè)
毒素可分為動(dòng)物毒素、植物毒素和微生物毒素,
其中微生物毒素包括細(xì)菌毒素、真菌毒素和藻類(lèi)毒素
等。毒素對(duì)食品生產(chǎn)各個(gè)環(huán)節(jié)的危害性很大, 極少量
即可引起人中毒, 因此加強(qiáng)對(duì)其檢測(cè)至關(guān)重要。
脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol, DON) 又
稱嘔吐毒素, 主要由禾谷鐮刀菌產(chǎn)生, 被歐盟分類(lèi)為
三級(jí)致癌物。Bin 等[17]在用AlphaLISA 技術(shù)檢測(cè)谷
物及制品中的DON時(shí), 通過(guò)DON－BSA包被發(fā)光微
粒和DON 競(jìng)爭(zhēng)DON 抗體, 與生物素化羊抗兔IgG
以及包被有鏈霉親和素的感光微粒形成復(fù)合體, 建
立間接競(jìng)爭(zhēng)DON 定量檢測(cè)方法, 結(jié)果顯示其靈敏度
達(dá)到0.007 ng/mL, 檢測(cè)范圍為0.007～100 ng/mL,。
該方法是目前DON 檢測(cè)中最靈敏的方法之一。
微囊藻毒素(microcystin)是一種從藍(lán)藻水華中分
離出的多肽毒素, 微囊藻毒素-LR 是毒素最強(qiáng)的一
種。我國(guó)生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)限制飲用水中該毒素含量為
1 μg/L。鈕偉民等[18]建立了微囊藻毒素-LR(MC-LR)
的納米均相時(shí)間分辨熒光免疫分析法, 將偶聯(lián)的
MC-LR 的牛血清白蛋白(MC-LR-BSA)人工抗原連
接到發(fā)光微粒, 抗MC-LR 單克隆抗體和親和素通過(guò)
生物素連接感光微粒, MC-LR 人工抗原特異性地與
第1 期洪小柳, 等: AlphaLISA 技術(shù)在食品安全檢測(cè)中的研究進(jìn)展 201
生物素抗 MC-LR 單克隆抗體結(jié)合, 形成一個(gè)免疫復(fù)
合物, 拉近感光微粒和發(fā)光微粒, 激發(fā)級(jí)聯(lián)放大化學(xué)
反應(yīng)以大幅增強(qiáng)信號(hào)。其檢出限達(dá)0.02 ng/mL, 與
MC-LR 的其他免疫測(cè)定法相比, AlphaLISA 方法的
操作簡(jiǎn)便、耗時(shí)短、高靈敏度、穩(wěn)定性好的特點(diǎn), 尤
其適合于生活飲用水中微量MC-LR 的分析。
3.2 食品中獸藥殘留物的檢測(cè)
動(dòng)物源性食品中的獸藥殘留問(wèn)題近年來(lái)日益受
到人們的關(guān)注, 是食品安全中最重要的問(wèn)題之一。動(dòng)
物性食品中最常見(jiàn)的獸藥殘留是抗生素的殘留。
江南大學(xué)的趙莉莉[19]建立了恩諾沙星的兩種免
疫檢測(cè)方法, 包括時(shí)間分辨免疫(TRFIA)和均相熒光
免疫技術(shù)(LICLIA)。恩諾沙星是一類(lèi)具有良好殺菌效
果的動(dòng)物專(zhuān)用藥。TRFIA 法主要是利用雙功能螯合
劑標(biāo)記稀土銪離子和抗體, 采用兩步法間接競(jìng)爭(zhēng)模
式, 該檢測(cè)靈敏度為5 ng/L, 檢測(cè)范圍為0.01~100
μg/L。LICLIA 法中最重要的影響因素是選擇合適的
稀釋比例, 該實(shí)驗(yàn)中選擇了Enrofloxacin-OVA-發(fā)光
珠 1: 500、抗恩諾沙星多克隆1: 2500、生物素化羊
抗兔抗體1: 200 的濃度稀釋比例, 兩步反應(yīng)僅需要
30 min, 其方法靈敏度為2 ng/L, 檢測(cè)范圍為
0.007~100 μg/L, 將兩種免疫檢測(cè)方法和酶聯(lián)免疫分
析法(ELISA)進(jìn)行方法相關(guān)性的比較, 結(jié)果表明三種
方法的相關(guān)性很好, LICLIA 法的靈敏度最高, 可應(yīng)
用于樣品更復(fù)雜的檢測(cè)目的。
氯霉素(Chloramphenicol)是一種廣譜抗生素。由
于其具有效果好以及價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn), 已被普遍應(yīng)
用于各類(lèi)家禽、家畜、水產(chǎn)品及蜂制品的各種傳染性
疾病的治療。Zhang 等[20]首次用AlphaLISA 法對(duì)牛
奶、蜂蜜和雞蛋中的氯霉素(CAP)進(jìn)行檢測(cè)時(shí), 因
CAP 作為小分子物質(zhì), 是半抗原沒(méi)有免疫原性, 故
采用混合酸酐法活化, 再與大蛋白偶聯(lián), 形成
CAP-BSA 和CAP-OVA 結(jié)合物。該方法的靈敏度為
0.0086 ng/mL, 低于ELISA方法的靈敏度0.05 ng/mL,
檢測(cè)范圍為0.0096~20 ng/mL,可達(dá)3-5 個(gè)數(shù)量級(jí), 整
個(gè)操作在30 min 內(nèi)完成, 可以進(jìn)行384、1536、3456
孔板的高通量檢測(cè)。
4 展 望
近年來(lái), 食品安全的重要性越來(lái)越凸顯, 動(dòng)物
源性食品在人們的日常生活中所占比重越來(lái)越大,
盡快建立食品中獸藥和生物毒素等有害物質(zhì)殘留的
高靈敏快速篩選檢測(cè)方法已成為當(dāng)務(wù)之急。目前, 食
品中獸藥和生物毒素有害物質(zhì)殘留的檢測(cè)方法包括
氣質(zhì)聯(lián)用法、液質(zhì)聯(lián)用法、放射受體法(Charm II)和
酶聯(lián)免疫法(ELISA)[21]。氣質(zhì)聯(lián)用法和液質(zhì)聯(lián)用法檢
測(cè)靈敏度高、特異性強(qiáng)但普遍存在著儀器昂貴, 方法
復(fù)雜, 操作煩瑣, 試劑消耗量大的局限性, 不適用快
速檢測(cè)技術(shù); 放射受體法(Charm II) 法可達(dá)到
μg/kg(ppb)級(jí)的檢測(cè)靈敏度, 但由于檢測(cè)的物質(zhì)范圍
有限, 而且檢測(cè)成本居高不下, 其推廣應(yīng)用受到限制;
酶聯(lián)免疫法(ELISA)由于操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)成本低和檢
測(cè)通量高而被廣泛應(yīng)用, 是目前最為高效和普遍使
用的檢測(cè)篩選技術(shù), 但隨著食品檢測(cè)向著更加痕量
級(jí)發(fā)展, 傳統(tǒng)ELISA 的靈敏度已不能滿足快速檢測(cè)
的要求。
AlphaLISA 技術(shù)是超微量檢測(cè)領(lǐng)域中出現(xiàn)的新
興檢測(cè)技術(shù), 被譽(yù)為免洗的ELISA, 具有快速、均相
(免洗)、高靈敏、量程寬和操作簡(jiǎn)便的特點(diǎn)[22,23], 非
常便于快速篩選和自動(dòng)化。目前, 高通量的生物標(biāo)志
物篩選分析對(duì)于自動(dòng)化檢測(cè)儀器平臺(tái)的要求較迫切,
AlphaLISA 技術(shù)將是未來(lái)致病菌、生物毒素和抗生素
殘留快速檢測(cè)平臺(tái)的發(fā)展方向。
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(責(zé)任編輯: 張宏梁)
作者簡(jiǎn)介
洪小柳, 本科，工程師，主要研究方
向?yàn)槭称肺⑸锛矮F藥殘留檢測(cè)。
E-mail: siluerhxl@163.com
趙芳, 碩士, 工程師, 主要研究方向
為食品微生物及獸藥殘留檢測(cè)。
E-mail: zf.ff@163.com

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